反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用*廣泛的技術(shù),主要是因?yàn)樗m用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相本質(zhì)上都是疏水物質(zhì),因此,分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小程度來(lái)分離的,樣品基體中其它疏水雜質(zhì)組分也能以同樣的方式保留。
反相色譜柱是一種常用的色譜柱產(chǎn)品,主要由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成,被廣泛用于多個(gè)領(lǐng)域中。在反相色譜柱的使用中,保持色譜柱的柱效、容量和滲透特性,延長(zhǎng)柱子的使用壽命非常重要。使用時(shí)間后就會(huì)出現(xiàn)柱壓升高、柱效降低、峰形畸變和分離度降低、保留時(shí)間改變等變化,如不采取措施,將會(huì)縮短色譜柱的使用壽命,影響工作效率,并造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。
有哪些因素會(huì)影響到反相色譜柱呢?
(1)柱長(zhǎng)
有機(jī)小分子和肽類的分辨率隨柱長(zhǎng)的增加而增加.但是柱長(zhǎng)增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加.它們?cè)谳^短的柱子上往往也有很好的分離效果。
(2)流動(dòng)相的流速。
有機(jī)小分子和肽類的分辨率對(duì)流動(dòng)相流速非常敏感。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小,柱子越長(zhǎng),色譜峰的寬度就越大,分辨率就越小。制備色譜上樣過(guò)程中的流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附容量影響很大。
(3)溫度。
溫度上升,流動(dòng)相黏度下降,流動(dòng)速度加快,且流動(dòng)相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快,使分辨率增加。同時(shí),溫度上升,分子熱運(yùn)動(dòng)增加,疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標(biāo)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。
(4)流動(dòng)相組成。
流動(dòng)相的極性越大,溶質(zhì)的分配系數(shù)越大,洗脫時(shí)間越短。RPC多采用降低流動(dòng)相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性zui強(qiáng)的溶劑,在反相色譜中常常和基礎(chǔ)溶劑配合使用,向流動(dòng)相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑,以得到不同強(qiáng)度的流動(dòng)相,這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中zui常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈。此外,乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機(jī)溶劑梯度的大小也會(huì)影響分辨率,一般梯度越?。直媛试酱蟆?/div>