SEC-MALS：讓腺相關(guān)病毒 (AAV) 表征更上一層樓

文/Tosoh Bioscience應(yīng)用科學(xué)家Heidi Vitrac, Ph.D.

前言

新冠疫情把病毒變成了每個人共同的一段切身經(jīng)歷，盡管如此，我們?nèi)孕栌涀?，并非所有的病毒都是危險的。事實(shí)上，一些病毒能夠起到輸送生物治療劑的作用。在進(jìn)行基因治療時常會用到這項(xiàng)技術(shù)，可以通過修改患者基因達(dá)到治療或治愈疾病的效果?；蛑委熤饕譃橐韵聨追N方式：通過專業(yè)技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)正?；虻目截惻c致病基因的替換，使功能異?；蚴Щ?，或向體內(nèi)引入新基因或修飾基因。

選擇方案三時，病毒載體——特別是使用AAV的病毒載體，可以說是極為有用。首先，由于其固有的自然設(shè)計(jì)，病毒載體進(jìn)入細(xì)胞的效率非常高。其次，該病毒載體的復(fù)制需依賴于與其他病毒的共感染，這點(diǎn)使其不具有致病性。最后，至少有12種不同人血清型AAV，其各自感染的細(xì)胞類型不同，使其可用于靶向特定類型細(xì)胞的治療。

AAV載體是由蛋白質(zhì)和DNA組成的有著精確構(gòu)造的復(fù)雜生物分子組合。理想情況下，科學(xué)家可以造出含預(yù)期單鏈DNA的細(xì)胞衣殼。但是，系統(tǒng)存在產(chǎn)生無任何DNA的空衣殼及部分填充的衣殼的風(fēng)險，這些不良衣殼可能會導(dǎo)致治療無效或療效降低。因此，開發(fā)生產(chǎn)及測量AAV衣殼的可靠方法

是非常需要的，包括但不限于測量DNA屬性（如基因組完整性、AAV DNA修飾和衣殼中存在的部分DNA）以及衣殼自身屬性（如衣殼的特性、病毒蛋白占比、聚集體等）。這正是SEC和MALS可以發(fā)揮作用的地方，特別是在給藥試驗(yàn)中基因組滴度測定及聚集體或空殼、部分和完整AAV測定方面。

SEC-MALS的威力

要了解SEC-MALS法的威力，首先要了解光散射分析的優(yōu)勢和過程。光束照射到溶液中的分子時，分子內(nèi)會產(chǎn)生振蕩偶極子，此時光會向各個方向重新射出。一般來說，光的射出量與分子量有關(guān)；但是，散射光的強(qiáng)度隨其散射方向不同而有所差異。為了收集到非常精確的分子測量數(shù)據(jù)，應(yīng)從多個不同角度來測量散射光。

東曹生命科學(xué)的LenS₃ MALS檢測器從極小角度（10度）、極大角度（170度）和直角，三角度散射光檢測模式，來計(jì)算分子大小。根據(jù)分子是大還是小，可以調(diào)用不同的角度。檢測器單次運(yùn)行即可獲得三個關(guān)鍵質(zhì)量屬性的量化數(shù)據(jù)：顆粒濃度、衣殼含量和聚集度。典型的儀器配置如圖1所示。事實(shí)上，該方法的主要優(yōu)勢是其所需的系統(tǒng)改造最小也很簡單。

分析高分子量的AAV時，首先必須選擇合適的東曹TSKgel^® SEC色譜柱才能獲得分析和鑒定各種雜質(zhì)所需的合適分離度（圖2）。

然后，可以根據(jù)具體分析和需求進(jìn)行深入優(yōu)化或微調(diào)。最后，SEC-MALS從三個方面為AAV表征提供最有力的方法支持：使用LenS₃實(shí)現(xiàn)超高靈敏度，測定完整／空殼比率時的增強(qiáng)準(zhǔn)確度，及測定AAV聚集體和雜質(zhì)的能力。

靈敏度和準(zhǔn)確度

總的來說，相較于傳統(tǒng)UV檢測，LenS₃檢測的靈敏度優(yōu)勢明顯（圖3）。與UV260和UV280檢測相比，MALS法的靈敏度明顯更高，特別是檢測AAV時，由于這些病毒的分子量相當(dāng)大，因此其后續(xù)在MALS中的光散射信號響應(yīng)十分強(qiáng)。事實(shí)上，如果所選的色譜柱適當(dāng)，即使?jié)舛葮O低，如每毫米粒子數(shù)僅為4×10⁹，也可以使用MALS實(shí)現(xiàn)檢測。另外，研究表明，直角光散射（RALS）信號和衣殼含量在較大的濃度范圍內(nèi)呈明顯的線性相關(guān)，這為顆粒定量測定置信度提供了保證。

制備AAV時一般會產(chǎn)生三類衣殼：空衣殼（不含單鏈DNA）、部分衣殼（含完整長度基因組DNA的片段）和完整衣殼（含所需基因組材料的完整長度）。由于所需產(chǎn)品是完整的AAV衣殼，因此測定完整／空衣殼占比是一個關(guān)鍵的質(zhì)量屬性要求。目前，SEC-MALS法尚且無法區(qū)分完整衣殼和部分衣殼，僅可區(qū)分完整衣殼和空衣殼。

好消息是，同樣的SEC-MALS法測定分子量的能力十分強(qiáng)大，也可用于測定AAV衣殼的DNA含量。如圖4所示，將RALS信號強(qiáng)度與預(yù)期百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，研究人員發(fā)現(xiàn)RALS信號與衣殼DNA含量之間呈明顯的線性相關(guān)。簡而言之，該方法能夠精準(zhǔn)預(yù)測分子量，將制劑中空衣殼含量降低至2%左右。

SEC-MALS法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度明顯優(yōu)于280 nm和260 nm的UV檢測法，這要?dú)w功于科學(xué)家能夠制備出更高密度完整衣殼混合物樣品，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的信號響應(yīng)。

利用MALS還可以最大限度地降低測定DNA時的不準(zhǔn)確度。隨著細(xì)胞內(nèi)DNA含量的增加，細(xì)胞本身變得更加堅(jiān)實(shí)，細(xì)胞內(nèi)能量減少的檢測也變得更加容易。這些附加數(shù)據(jù)的獲取能夠增加測定完整／空衣殼比率的置信度。本質(zhì)上講，SEC-MALS法更容易識別蛋白質(zhì)的聚集體和片段，同樣歸功于LenS₃檢測器具有出色的靈敏度。

未來應(yīng)用

AAV下游工藝的主要挑戰(zhàn)之一是有效分離所需的完整AAV與純化后的殘留雜質(zhì)。如果將SEC-MALS法用于未純化樣品，能否應(yīng)對這一挑戰(zhàn)？

結(jié)果顯示，大部分雜質(zhì)可通過較高的UV響應(yīng)（如：UV@280 nm，16分鐘內(nèi)）檢測出來。但UV檢測法對于完整的AAV并不適用。事實(shí)上，由于密度問題，14.5分鐘左右時仍未檢測到AAV衣殼的UV信號。這也是SEC-MALS法發(fā)揮作用的地方，它能夠檢測和定量具有復(fù)雜基質(zhì)的樣品。簡而言之，SEC-MALS法為分析各種血清型的AAV提供了高靈敏度、穩(wěn)健的工具。這一論斷對生產(chǎn)和質(zhì)量控制兩個階段都適用。

SEC-MALS也可用于分析AAV以外的其他病毒?？茖W(xué)家總能想出新的基因遞送策略，東曹生命科學(xué)也總有相應(yīng)策略與之應(yīng)對。對小病毒顆粒研究得出了與AAV的試驗(yàn)相似的結(jié)果，并實(shí)現(xiàn)了高效分離。東曹生命科學(xué)對這些病毒顆粒進(jìn)行了高效分離和分子量測定，通過質(zhì)量單位與能量換算得出12.8納米的結(jié)果——與該病毒顆粒的報告值匹配。簡而言之，SEC-MALS法不僅可應(yīng)用于AAV，也為其他各種應(yīng)用創(chuàng)造了無限可能。