離子交換色譜柱常見(jiàn)問(wèn)題分析

離子交換色譜的基本原理：

離子交換色譜是蛋白純化技術(shù)中常用的一種純化方法，其原理是指被分離物質(zhì)所帶的電荷可與離子交換劑所帶的相反電荷結(jié)合，這種帶電分子與固定相之間的結(jié)合作用是可逆的，在改變pH或者用逐漸增加離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫時(shí)，離子交換劑上結(jié)合的物質(zhì)可與洗脫液中的離子發(fā)生交換而被洗脫到溶液中。由于不同物質(zhì)的電荷不同，其與離子交換劑的結(jié)合能力也不同，所以被洗脫到溶液中的順序也不同，從而被分離出來(lái)。

離子交換色譜柱常見(jiàn)問(wèn)題分析：

1.純化后樣品純度不高怎么辦？
?若目標(biāo)蛋白和雜蛋白等電點(diǎn)差異較大，目標(biāo)蛋白通過(guò)穿透步驟獲得，通過(guò)調(diào)節(jié)起始緩沖液pH，使目標(biāo)蛋白與填料之間的靜電作用更強(qiáng)；
?若目標(biāo)蛋白和雜蛋白等電點(diǎn)差異較小，目標(biāo)蛋白通過(guò)洗脫步驟獲得，過(guò)調(diào)節(jié)起始緩沖液pH，使目標(biāo)蛋白與填料之間的靜電作用更強(qiáng)；再調(diào)節(jié)洗脫溶液的離子強(qiáng)度和pH，使目標(biāo)蛋白與雜蛋白逐漸分離；
?選擇合適的離子交換填料及粒徑；
?柱沒(méi)有經(jīng)過(guò)起始緩沖液的充分平衡；
?降低洗脫流速；
?調(diào)整樣品溶液黏度。
2.純化后的蛋白收率較低怎么辦？
?調(diào)整樣品pH，使樣品pH與起始緩沖液pH保持一致；
?改變洗脫模式，如將線(xiàn)性梯度模式改變?yōu)殡A段性梯度洗脫；
?改變洗脫方法，如將pH洗脫方法改為鹽梯度洗脫方法；
?改變洗脫強(qiáng)度。
3.樣品過(guò)于粘稠怎么處理？
?樣品過(guò)于粘稠可能是由于含有的蛋白太多，或者含有大分子量的核酸分子，通常有以下解決方法：
?增加裂解前稀釋細(xì)胞所用體積；
?增加裂解時(shí)間，直至黏度下降，或者增加DNase和Mg2+的劑量；
?增加機(jī)械裂解細(xì)胞的效率；
?降低上樣流速。